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瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒
Midi Purification Kit
保存條件:本試劑盒在室溫儲(chǔ)存 18 個(gè)月不影響使用效果。
產(chǎn)品介紹:
在高離序鹽存在的情況下,DNA-* 片斷選擇性的吸附于離心柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜上,再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟,漂洗液將引物、核苷酸、蛋白、酶等雜質(zhì)去除,后用低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。
產(chǎn)品特點(diǎn):
1. 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口特制吸附膜,柱與柱之間吸附量差異極小,可重復(fù)性好??朔藝a(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2. 使用了溶膠液,不含傳統(tǒng)溶膠液的碘化那和高氯酸鹽,不抑制回收后酶切、連接克隆等下游反應(yīng)。
3. 溶膠液調(diào)制成為了黃顏色,便于觀察溶膠效果和監(jiān)測(cè)pH值變化從而達(dá)到li想結(jié)合效果,大大提高回收效率。
4. 注意事項(xiàng):
1. 所有的溶液應(yīng)該是澄清的,如果環(huán)境溫度低時(shí)溶液可能形成沉淀,此時(shí)不應(yīng)該直接使用,可在37℃水浴加熱幾分鐘,即可恢復(fù)澄清。使用前應(yīng)該恢復(fù)到室溫。
2. 儲(chǔ)存于低溫(4℃或者-20℃)會(huì)造成溶液沉淀,影響使用效果,因此運(yùn)輸和儲(chǔ)存均在室溫下(15℃-25℃)進(jìn)行。
3. 避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH 值變化,各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。
4. 溶膠液中含有刺激性化合物,操作時(shí)要戴乳膠手套,避免沾染皮膚,眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí),要立即用大量清水或者生理鹽水沖洗。
5. 回收純化的DNA-*片段一般在100bp到40kb之間,過長、過短片段的回收效率降低。
6. 回收DNA的量和起始DNA的量、洗脫體積、DNA-*片斷大小有關(guān)。一般1-20μg,100bp-5kb的DNA-*片段,回收率可高達(dá)85%-95%。
7. 切膠回收時(shí),紫外燈觀察對(duì)DNA-*片段有損壞作用,應(yīng)該盡可能使用能量低的長波紫外線,并且盡可能的縮短紫外線下處理的時(shí)間。
8. pH值≤7.5時(shí),吸附膜吸附DNA的效率-*高。如果切下來的凝膠中含有電泳緩沖液太多,造成溶膠后溶膠液pH偏高,會(huì)導(dǎo)致回收率降低。溶膠后,如果溶膠液依舊保持黃色,說明pH正常;如果變成橘紅色或者淡紫色,說明pH偏高,可在膠充分溶解后加5-10μl3M醋酸鈉(pH5.2)將pH值調(diào)到5-7(黃色)。
9. 洗脫液EB不含有螯合劑EDTA,不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫,但應(yīng)該確保pH大于7.5,pH過低影響洗脫效率。用水洗脫,DNA-*片段應(yīng)該保存在-20℃。DNA-*片段如果需要長期保存,可以用TE緩沖液洗脫(10mM Tris-HCl,1mM EDTA, pH 8.0),但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng),使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。
自備試劑:無水乙醇操作步驟:
提示:首次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入量無水乙醇,加入后請(qǐng)及時(shí)打鉤標(biāo)記已加入乙醇,以免多次加入!
1. 在長波紫外燈下,用干凈刀片將所需回收的DNA 條帶切下,盡量切除不含DNA 的凝膠,得到凝膠體積越小越好。
2. 將切下的含有DNA條帶凝膠放入1.5ml 離心管,稱重。
3. 加3倍體積溶膠液DD。(凝膠重為100mg,則加入300μl 溶膠液)
如果凝膠濃度大于2%,應(yīng)加入6 倍體積溶膠液。
4.56℃水浴放置10min(或直至膠*溶解)。每2-3min 渦旋震蕩一次加速溶解。
5. 可選,:每100mg 初的凝膠重量加入150μl 的異丙醇,震蕩混勻。
6. 將上一步所得溶液加入吸附柱EC 中(吸附柱放入收集管中),室溫放置1min,12,000rpm 離心30-60sec,倒掉收集管中的廢液。
7. 加入500μl 漂洗液WB(請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!),12,000rpm 離心30sec,棄掉廢液。
8. 重復(fù)操作步驟 7。
9. 將吸附柱EC 放回空收集管中,12,000rpm 離心2min,盡量去除漂洗液,以免漂洗液中殘留的乙醇抑制下游反應(yīng)。
10 取出吸附柱EC,放入一個(gè)干凈的離心管中,室溫放置數(shù)分鐘。
11.在吸附膜的中間部位滴加洗脫緩沖液EB(洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好),室溫放置 2min,12,000rpm 離心1min。如果需要較多量DNA,可將得到的溶液重新加入吸附柱中,離心1min。(注意:洗脫體積不應(yīng)小于30μl,體積過少影響回收效率)